Prospek Alginate pembekuan dalam Cryopreservation sel: pembekuan sel Stem Pluripotent manusia dengan Alginate

Dalam tiga isu pertama, kami berkongsi kajian D(+)-trehalose dihydrate dalam cryoprotection sel pelopor oligodendrocyte manusia (OPCs), sel stem yang berasal dari adipose (ADSCs), sel-sel kuman testicular tetikus, dan sebagainya. Kajian ini mendapati bahawa menambah jumlah yang sesuai D(+)-trehalose dihydrate kepada medium cryopreservation atau menggunakan cryoprotectant (CPA) Mengandungi D(+)-trehalose dihydrate dan glycerol boleh meningkatkan kadar pemulihan sel selepas cryopreservation jangka panjang.

Dalam isu ini, kami membangunkan pemahaman yang jelas tentang kesan cryoprotective D(+)-trehalose dihydrate dalam tiga sel stem pluripotent manusia yang berbeza melalui satu artikel yang diterbitkan dalamPenyelidikan sel StemPada tahun 2018 oleh penyelidik dari Milan, itali.

Cryopreservation sel Stem Pluripotent manusia dengan D(+)-Trehalose Dihydrate

Pengenalan

Produk terapi sel, termasuk sel stem, mempunyai potensi klinikal yang tinggi. Pasaran sel stem global melibatkan penyimpanan sel stem huluan dan huluan dan penyediaan serta aplikasi klinikal hiliran. Menurut laporan penyelidikan pasaran ketelusan (TMR), pasaran sel stem global dijangka mencapai as $270.5 bilion menjelang akhir 2025, dan kadar pertumbuhan tahunan kompaun pasaran berada di landasan yang betul untuk mencapai 13.8% dalam tempoh 8 tahun yang lalu.

Untuk memastikan penggunaan produk terapi sel yang berjaya, cryopreservation jangka panjang sel-sel adalah kesukaran teknikal yang mesti ditawan kerana cryopreservation adalah satu-satunya kaedah yang tersedia untuk pemeliharaan jangka panjang daya maju dan fungsi biokimia sel-sel.

Untuk mengelakkan kerosakan kepada struktur selular yang disebabkan oleh obligat pembekuan, cryoprotectants dibangunkan dan dipasarkan. Cryoprotectants sel yang paling biasa digunakan adalah dimetil sulfoxide (DMSO) dalam kombinasi dengan serum lembu janin (FBS) atau mana-mana pengganti serum.

Walau bagaimanapun, FBS mengandungi protein sintesis haiwan xenogenic yang boleh menyebabkan jangkitan zoonotic dengan patogen yang tidak diketahui. Di samping itu, DMSO adalah sitotoksik. Dilaporkan bahawa ketoksikan DMSO pada tisu dan sel secara langsung berkaitan dengan masa pendedahan, suhu, dan kepekatan. Tahap ketoksikan berbeza-beza mengikut jenis sel, dan kesan buruk telah dilaporkan pada pesakit yang disuntik semula dengan sel-sel thawed tanpa mengeluarkan DMSO. Di samping itu, DMSO dikenali untuk menjejaskan epigenome embryoids tetikus dengan mengawal selia tahap transkrip tiga DNA methyltransferases (Dnmts) dan mengubah seluruh genom methylation profil, yang seterusnya membawa kepada pembezaan sel stem tetikus yang tidak terkawal. Untuk semua sebab-sebab ini, DMSO + FBS tidak sesuai untuk kegunaan klinikal. Terdapat keperluan mendesak untuk membangunkan cryoprotectants yang cekap dan tidak toksik.

D(+)-trehalose dihydrate adalah disaccharide mengurangkan yang ditemui dalam pelbagai organisma yang mampu masih hidup lengkap dehidrasi, seperti bakteria, yis, tardigrades dan nematodes. Mamalia tidak menghasilkan D(+)-trehalose dihydrate, tetapi ia adalah cryoprotectant yang berkesan daripada sel-sel tidak, yang boleh mengurangkan kerosakan sel yang disebabkan oleh pembentukan hablur ais. Kesan perlindungan D(+)-trehalose dihydrate berkaitan dengan kesan osmotik dan interaksi khusus fosfolipid membran sel dan protein labile, yang boleh menghalang kerosakan sel dan denaturation disebabkan oleh desiccation dan tekanan oksidatif.

D-cytotoxic (+)-trehalose dihydrate telah berkesan digunakan untuk cryopreservation pelbagai jenis sel-sel seperti spermatocytes tetikus, sel stem hematopoietic dewasa, sel stem mesenchymal, sintesis adipose sel stem (ADSCs), sel stem embrio manusia (hecs) dan sel stem pluripotent manusia-berpunca dari (hiPSCs). D(+)-trehalose dihydrate juga digunakan untuk cryopreservation darah kord, sum-sum tulang dan pulau-pulau kecil manusia.

Halangan utama yang menghalang penggunaan meluas D(+)-trehalose dihydrate dalam pemeliharaan sel adalah bahawa ia adalah sukar untuk D(+)-trehalose dihydrate untuk mengakses bahagian dalam sel. Beberapa cara telah digunakan sebelum ini untuk menangani masalah, seperti kejutan osmotic, penghantaran liposome, perforation haba, electroporation, microinjection dan kejuruteraan genetik. Walau bagaimanapun, kaedah di atas memerlukan operasi yang kompleks, susah payah dan memakan masa, dan boleh menyebabkan kerosakan sel yang ketara.

Dalam kajian ini, tiga jenis garisan sel stem pluripotent telah cryopreserved dengan empat cryoprotectants berbeza yang disediakan menggunakan D(+)-trehalose dihydrate semata-mata atau dalam kombinasi dengan ethylene glycol atau glycerol, masing-masing. Garisan sel kemudian telah thawed untuk menyiasat parameter utama termasuk morfologi sel, daya maju pasca cairkan, pluripotency penanda ekspresi tahap, kestabilan penghibridan, endoplasmic reticulum (ER) homeostasis dan DNA kerosakan tindak balas, mengukur cap cryoprotectiveKelegapan cryoprotectants empat pada sel stem pluripotent.

Komposisi Cryoprotectant yang berbeza

Cryoprotectants semua baru disediakan dan dicairkan dalam fosfat buffered saline (PBS). Sel-sel yang digunakan dalam kajian cryopreserved menggunakan CS10. CS10 mengandungi 10% DMSO adalah cryoprotectant tanpa komponen serum dan haiwan, yang disyorkan untuk cryoprotection sel stem pluripotent manusia (hPSCs).

Cryopreservation dan pencairan sel-sel

Budaya sel-sel di bawah syarat-syarat tertentu. Dissociate hESCs-RC17 dengan EDTA 0.5 mM, merawat hiPSCs-CTR2 #6 dan ltNES-AF22 dengan penyelesaian detasmen sel, dan simpan di cryoprotectants baru disediakan (A, B, C dan D). Resuspend 2.0 × 10 ^ 6 sel dalam 1.5 mL setiap cryoprotectant dan pemindahan ke cryogenic bebuli.

Botol kriogenik sejuk dalam bekas beku pada kira-kira-1 ℃/min, dan dipindahkan ke peti sejuk pada-80 ℃ selepas penyimpanan semalaman. Selepas 24 h, pindahkan botol kriogenik ke nitrogen cecair untuk penyimpanan selama sekurang-kurangnya satu minggu.

Panaskan botol kriogenik dalam mandi air pada 37 ℃ sehingga jisim ais hilang, dan cairkan penggantungan sel dengan medium hangat. Kumpulkan sel-sel 200g tisu dengan sentrifugasi selama 3 minit dan benih ke kapal budaya bersalut sesuai untuk setiap jenis sel pada saiz inokulum yang ditunjukkan.

Keputusan dan perbincangan

① Sel maju

Ukur daya maju sel dengan ejen alamarBlue 48 h selepas pencairan.

Pertama, untuk menentukan jumlah yang sesuai D(+)-trehalose dihydrate, ethylene glycol dan glycerol, kepekatan berbeza penyelesaian komponen tunggal telah digunakan untuk garisan sel stem yang berbeza. Daya maju sel-sel selepas pencairan diukur dan berbanding dengan kumpulan kawalan. Keputusan menunjukkan bahawa 0.5 M D(+)-trehalose dihydrate, 10% ethylene glycol dan 10% glycerol adalah jumlah yang sesuai, tetapi terdapat perbezaan yang besar antara jenis sel stem yang berbeza.

Selepas menentukan kepekatan awal, empat cryoprotectants berbeza (lihat di atas) telah digunakan untuk cryopreservation tiga sel stem garisan: (kumpulan A) hESCs-RC17, (kumpulan B) hiPSCs-CTR2 #6, dan (kumpulan C) ltNES-AF22. Daya maju sel diukur selepas pencairan. Kadar survival sel adalah juga berbanding dengan sel-sel yang sama cryopreserved dalam CS10 di bawah keadaan yang sama.

Apabila sel-sel cryopreserved dengan D(+)-trehalose dihydrate sahaja (kumpulan A), kadar pemulihan sel-sel selepas pencairan menurun, berbeza-beza dari tahun 20% hingga 60% untuk jenis sel yang berbeza.

Apabila D(+)-medium berasaskan trehalose dihydrate telah ditambah dengan 10% ethylene glycol atau 10% glycerol (kumpulan C dan D), kadar survival sel hESCs-RC17 dan ltNES-AF22 mencapai tahap yang sama seperti yang cryopreserved dalam DMSO. Walau bagaimanapun, kadar survival sel hiPSCs-CTR2 #6 cryopreserved di glycerol adalah lebih baik daripada itu dalam ethylene glycol.

Di samping itu, membandingkan keputusan dengan cryoprotectants kawalan yang mengandungi ethylene glycol atau glycerol sahaja, ia telah disahkan bahawa kadar survival meningkat adalah disebabkan oleh kesan gabungan ethylene glycol/glycerol + D(+)-trehalose dihydrate.

Keputusan ini mencadangkan bahawa D(+)-trehalose dihydrate boleh digunakan untuk cryopreservation sel stem pluripotent manusia dan dijangka menggantikan DMSO, dan menambah 10% ethylene glycol atau 10% glycerol dengan ketara boleh meningkatkan kadar survival trehalose cryoprotectants. Kadar survival sel min telah meningkat berbanding CS10. Cryoprotectants ethylene glycol/glycerol dan D(+)-trehalose dihydrate tidak mengandungi protein serum dan mengelakkan risiko sebelum ini dilaporkan merangsang pembezaan pramatang sel stem pluripotent.

② Morfologi sel

Satu lagi kebimbangan denganCryopreservation sel stem adalah pengubahsuaian chromosomal dan pluripotency. Semasa pembekuan dan pencairan, kristal ais dan buih boleh membentuk di dalam dan di luar sel-sel, mengganggu spindle microtubules untuk mendorong pemisahan kromosom yang tidak normal dan mengakibatkan perubahan dalam ciri-ciri pertumbuhan sel dan morfologi. Oleh itu, kemungkinan kerosakan pada kromosom dan potensi sel stem pluripotent boleh dinilai dengan mudah dengan memerhatikan morfologi sel selepas pencairan.

Angka atas menunjukkan morfologi sel hESCs-RC17, hiPSCs-CTR2 #6 dan ltNES-AF22 48 h selepas pencairan. Imej kontras fasa menunjukkan bahawa komposit D( )-trehalose dihydrate cryoprotectants tidak menyebabkan perubahan abdi sendiri yang ketara dalam mana-mana garisan sel, dan morfologi sel adalah serupa dengan sel-sel yang dipelihara dalam CS10.

③ Penanda tahap ekspresi

Untuk mengesahkan bahawa hESCs-RC17, hiPSCs-CTR2 #6 dan ltNES-AF22 selepas pencairan mengekalkan sifat-sifat utama dan ciri-ciri sel stem pluripotent, tahap ekspresi beberapa penanda dianalisis oleh kuantitatif RT-PCR 48 h selepas pencairan.

Penanda sel Nanog, Oct4 dan Sox2 dikesan untuk hESCs-RC17 dan hiPSCs-CTR2 #6, dan berbanding dengan kumpulan kawalan.

Nestin dan Sox2 dikesan untuk ltNES-AF22 dan berbanding dengan kumpulan kawalan. Keputusan menunjukkan bahawa potensi pembezaan sel stem tidak terjejas.

④ Kestabilan kromosom

Untuk menilai kesan D( )-cryoprotectants berasaskan trehalose dihydrate pada kestabilan kromosom dalam sel stem, konvensional karyotyping dan aCGH telah dijalankan pada semua garisan sel stem tiga. Angka di bawah menunjukkan keputusan ltNES-AF22 sebelum dan selepas cryopreservation.

Secara keseluruhannya, karyotypes yang kekal stabil, tetapi variasi nombor salinan (CNVs) dikesan (kromosom 2, 8, 19 dan 22). Sebahagian daripada CNVs mungkin telah hadir dalam sel-sel utama dan lain-lain mungkin timbul secara rawak semasa manipulasi dalam vitro sel-sel dan bukannya cryopreservation, kerana tiada eanuploidy klon atau aberrations struktur kromosom diperhatikan sebelum (rajah C) dan selepas cryopreservation (rajah D).

⑤ ER tekanan/unfolded penilaian tahap protein

Kajian ini juga memberi tumpuan kepada sama ada cryopreservation CS10 atau D( )-trehalose dihydrate terjejas pluripotent sel-sel keupayaan untuk bertindak balas terhadap tekanan endoplasmic reticulum (ER) dan mengaktifkan tindak balas unfolded protein (UPR). Untuk mengekalkan homeostasis dalam keadaan fisiologi atau patologi yang berbeza, ER mengintegrasikan pelbagai isyarat molekul dan selular. Kedua-dua tekanan ER dan UPR menjadi pengantara mekanisme molekul dan biokimia yang mempengaruhi percambahan sel, pembezaan dan ke.

Secara keseluruhannya, D( )-trehalose dihydrate mempamerkan tahap sederhana ER tekanan/UPR berbanding CS10. Baris sel hanya lebih sensitif adalah hiPSCs-CTR2 #6, yang menunjukkan tahap ekspresi gen BIP dan potong yang lebih tinggi dalam kumpulan B dan C, menunjukkan bahawa cryopreservation dengan D( )-trehalose dihydrate tidak ketara mengubah homeostasis ER sel stem multipotent berbanding CS10.

Kesimpulan

Cryopreservation jangka panjang sel stem mempunyai potensi aplikasi yang besar dalam pelbagai bidang seperti pemindahan sel dan terapi sel. Beberapa kajian telah mengoptimumkan cara untuk cryopreservation sel stem pluripotent manusia, dan cryopreservation jangka panjang dengan D( )-trehalose dihydrate mungkin satu kaedah yang ideal.

Sel stem pluripotent manusia yang dipelihara dalam D( )-trehalose dihydrate cryoprotectants mengekalkan phenotypes selular dan sifat-sifat fungsi, menunjukkan potensi penggunaan D( )-trehalose dihydrate dalam terapi klinikal. Walaupun kajian lanjut diperlukan untuk menilai biosafety sel-sel cryopreserved dengan komposit D( )-trehalose dihydrate cryoprotectants, gabungan D( )-trehalose dihydrate dengan ethylene glycol atau glycerol, sebagai cryoprotectant biosafety dengan tiada sitotoksisiti atau protein haiwan yang diperolehi, menunjukkan janji yang besar untuk aplikasi klinikal.